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Articulo original Acta Pharmacologica Sínica (2009) 30: 184 & # x02013; 192; doi: 10.1038 / aps.2008.27 Oxidativo modulación de marcaına y lekoptin en mioblastos de rata H9c2 Julita Julita Kulbacka 1. 3. Barra de Agnieszka Chwilkowska 1. Malgorzata Malgorzata Dumanska 2. Arrastrar Zalesinska 2. Teresa Wysocka 2. Kamilla Stach 1. Iwona Bednarz 1. Mateusz Lugowski 1. Anna Marcinkowska 1. Andrzej GAMIAN 1 y Jolanta Saczko 1 1 Departamento de Bioquímica Médica, Universidad Médica de Wroclaw, 50-368 Wroclaw, Polonia Departamento de Histología y Embriología, Universidad de Medicina de Wroclaw, 50-368 Wroclaw, Polonia 2 3 Departamento de Inmunología Clínica, Universidad de Medicina, 50-368 Wroclaw, Polonia Correspondencia: Dr. Julita Kulbacka, PhD. julitab@bioch. am. wroc. pl E-mail Recibido el 24 de septiembre de 2008; Aceptado 18 de diciembre de 2008. Abstracto Objetivo: La citotoxicidad de marcaına se estimó en combinación con un bloqueador de los canales de calcio. Además, se investigó la influencia de marcaına y marcaına más lekoptin en un sistema modelo usando la línea celular cardiaca H9c2. métodos: Las células se incubaron durante cinco horas con marcaına, lekoptin, o con ambos fármacos simultáneamente. Se detectaron células apoptóticas usando el ensayo de TUNEL y el ensayo cometa alcalino. la función celular mitocondrial después de la captación del fármaco se examinó utilizando el ensayo de MTT. La concentración de MDA (malondialdehído) & # x02014; el producto final de la peroxidación de los ácidos grasos, se cuantificó espectrofotométricamente. La expresión de la glutatión S transferasa & # x003C0; (GST & # x003C0;) se detectó por inmunofluorescencia (IF) y Western Blot (WB) y óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica (ABC). resultados: La incubación con marcaına resultó en el mayor número de células apoptóticas. Después de la incubación con tanto marcaına y lekoptin, daños moderados en las células se observó (54,2 & # x00025; & # x000B1;; 1.775 & # x00025 de la destrucción del ADN). Los mayores niveles de iNOS y GST-& # x003C0; se observó expresión en las células tratadas con marcaına y marcaına más lekoptin. La característica nuclear GST & # x003C0; se observó expresión en las células tratadas con ambos fármacos. Conclusión: Lekoptin estimuló las células para proliferar. Marcaına causó daños en la membrana celular y finalmente la muerte. Palabras clave: mioblastos cardiacos, marcaına, lekoptin, estrés oxidativo, apoptosis, GST-& # x003C0 ;. iNOS Introducción Calcio actúa como un mensajero intracelular para modular muchos aspectos de la fisiología celular. la señalización de calcio intracelular juega un papel esencial en la fisiología cardiaca y modula la expresión de genes cardiacos. Sin embargo, el papel de la señalización de calcio intracelular durante el desarrollo cardiaco y la capacidad de calcio para modular la diferenciación de las células del músculo estriado son poco conocidos 1. 2. 3. 4. El objetivo principal de la acción cardiotóxicos de marcaına se considera generalmente que los canales de sodio dependientes de voltaje. Los resultados de los estudios cardíacos aislados, así como otros estudios sugieren que las acciones de bupivacaína (marcaına) en los canales de sodio probablemente contribuyen a los efectos cardiotóxicos 5. 6. 7. Algunos autores han señalado que el óxido nítrico (NO) actúa en la señalización de calcio como una mensajero inter e intracelular en diversos tipos de células. estimulación patógenos, como respuesta inflamatoria, puede inducir la producción de NO, que es mediado principalmente por la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). El papel de la generación de NO por los cardiomiocitos y la expresión de isoformas de NOS todavía no está claro. Los cardiomiocitos se han reportado para expresar dos isoformas de NOS. endotelial e inducible, en estados de enfermedad 8. 9. 10. También se informó de que las células cardíacas expresan ni iNOS eNOS ni inmunoreactividad en tanto infracted y normal miocardio 11. 12. 13. Las enzimas antioxidantes importantes que protegen las células del estrés oxidativo son SOD, glutatión S transferasa, catalasa y glutatión peroxidasa 14. glutatión S transferasa & # x003C0; (GST-& # x003C0;) está implicado en una variedad de procesos de desintoxicación celular. Hemos investigado el nivel de expresión de GST-& # x003C0; En las células tratadas con los medicamentos utilizados comúnmente. expresión de GST-& # x003C0 Aumento; en diferentes células normales y tumorales se asocia con una menor sensibilidad a los citostáticos. El estrés oxidativo es un componente importante de la apoptosis inducida por citostáticos. GSTs se cree que desintoxicar sustancias endógenas que se forman como consecuencia del estrés oxidativo, incluyendo hidroperóxidos de lípidos y hidroxialquenales. Por lo tanto, el aumento de GST-& # x003C0; la expresión en células puede protegerlos contra el estrés oxidativo inducido por fármacos y, por lo tanto, la apoptosis 5. Isomoto et al hipótesis de que algunos medicamentos antiarrítmicos pueden causar cardiotoxicidad a través de la inducción de la apoptosis 15. Se sabe poco acerca de la oxidación de drogas y la toxicidad en el corazón. La cardiotoxicidad se produce durante el tratamiento con varios fármacos citotóxicos y puede ser el factor limitante de la dosis en el tratamiento y celular respuesta 16. Lekoptin se utiliza a menudo para el tratamiento de la arritmia ventricular y es un potente bloqueador de los canales de calcio. Walles et al mostraron que el tejido del corazón que se metabolizan con éxito verapamil 17. Otros autores han demostrado un aumento de la cardiotoxicidad cuando la doxorrubicina se administró en combinación con verapamil y se han propuesto varios mecanismos diferentes para este efecto. Un mecanismo se basa en la capacidad de verapamil para inhibir la función de P-glicoproteína y, por tanto, aumentar las concentraciones de drogas citotóxicas intracelulares. Este efecto puede ser útil para la quimioterapia del cáncer, sino que también podría dar lugar a efectos tóxicos en las células normales, como las células cardiacas 16. Sin embargo, algunos estudios muestran un aumento de la acumulación de doxorubicina en cardiomiocitos de rata incubadas en doxorrubicina en combinación con verapamilo 18. 19. En otro estudio, la inhibición de tipo L de Ca 2 & # x0002B; canales estaba implicado en la depresión cardíaca inducida por bupivacaína (marcaına), lo que provoca un efecto más fuerte arritmogénica y está probablemente relacionado con el enantiómero específico de unión a Na & # x0002B; o K & # x0002B; canales 20. Los autores encontraron un efecto aumento cardiotóxicos (arritmias) causado por R (& # x0002B;) bupivacaína, en comparación con S (& # x02212;) 20. bupivacaína bupivacaína es uno de los anestésicos más utilizados en la medicina contemporánea, especialmente en obstetricia. Se bloquea los canales de sodio, con la consiguiente retraso de la producción de estímulo y la conducción, y también causa el estrés oxidativo, lo que lleva a la muerte celular 21. 22. Cesselli et al concluyó que esto podría constituir el evento más proximal en la insuficiencia cardíaca 23. Sin embargo, Lenfant et al indicó que la bupivacaína fue eficaz en la protección contra el estrés oxidativo eritrocitos 24. 25. Hemos realizado estudios sobre H9c2 células, que son una línea celular de mioblastos de rata que diferencia in vitro. Se examinó la influencia del tipo L lekoptin bloqueador del canal de calcio (verapamilo), la marcaına anestésico local, y una combinación de estos dos agentes. Ambos fármacos se utilizan en la práctica médica común; Por lo tanto, es importante analizar sus acciones en el cuerpo humano. Uno de los primeros eventos que se pueden estudiar es el estrés oxidativo, una alteración del equilibrio del pro y antioxidantes. El objetivo de este estudio incluyó la determinación de las toxicidades relativas de marcaına y lekoptin, los factores que predisponen a las células toxicidad, los mecanismos de estos efectos tóxicos, y las acciones de estos fármacos. materiales y métodos Cultivo de células las células del miocardio corazón de rata H9c2 (un regalo del profesor Fluvio URSINI de la Universidad de Padua) se cultivaron en medio DMEM (Sigma) con la adición de 10 & # x00025; suero bovino fetal (FBS), 2 mmol / L de glutamina, 10 4 & # x000D7; diluyeron 10 000 U / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina (Sigma), y 0,05 mmol / L selenita (Sigma). Para los experimentos, las células se eliminaron mediante tratamiento con tripsina y se lavaron con PBS. Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada a 37 & # x000B0; C en 5 & # x00025; CO 2. El cultivo con marcaına y lekoptin Marcaına y lekoptin (Polfa, Polonia) se obtuvieron del Dr. Z SACZKO del Hospital de Wroclaw, Polonia los Especialistas A. Falkiewicz '. Las células se incubaron durante cinco horas en tres combinaciones de concentraciones utilizadas clínicamente: con marcaına (CM = 6 & # x003BC; g / ml), con lekoptin (verpamili hydrochloridum) (CL = 952 & # x003BC; g / ml), y ambos fármacos simultáneamente. El tiempo de incubación de cinco horas fue establecido a partir de experimentos anteriores. Esta vez fue óptima para la observación de la interacción entre las drogas y células. Peroxidación lipídica Después del tratamiento in vitro con los fármacos. se separaron las células por tripsinización y se resuspendieron en PBS. El producto final de la peroxidación de los ácidos grasos, el malondialdehído (MDA), reacciona con TBA para formar un complejo coloreado. El nivel de TBARS se midió por la absorbancia a una longitud de onda de 535 nm. La concentración de MDA se cuantificó espectrofotométricamente basa en un conjunto de normas de MDA de concentración conocida. ensayo cometa alcalino (ACA) Para la detección de fragmentación de ADN asociado a la apoptosis, se usó el método de ensayo de cometa alcalino 26. Las células a una concentración de 1 y # x000D7; 10 5 / ml se mezclaron con agarosa de bajo punto de fusión (Sigma) en una proporción de 1: 10 (v / v) y se extendió en una diapositiva. Los portaobjetos se sumergieron en solución preenfriada de lisis (/ L NaCl, 100 mmol / l de EDTA, pH 10, 10 mmol base / L Tris 2,5 mol, y 1 & # x00025; Triton X-100) a 4 & # x000B0; C para 60 min. Después de ser lisadas y enjuagados, los portaobjetos se equilibraron en solución TBE (/ L Tris ácido 40 mmol / bórico, 2 mmol / l de EDTA, pH 8,3), a electroforesis a 1,0 V / cm 2 durante 20 min, y se tiñeron utilizando la tinción con plata 27. método para marcar el patrón de cometa, 100 & # x02013; 200 núcleos de cada diapositiva se contaron por dos investigadores independientes. La apoptosis - ensayo de TUNEL la fragmentación del ADN se visualizó usando un ApopTag & # x000AE; (Qbiogene) kit. En el ensayo de TUNEL la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal etiqueta el x02032 3 & #; - OH extremos de ADN generado durante la apoptosis con nucleótidos biotinilados. Estos fragmentos se detectan por tinción con inmunoperoxidasa. El kit de detección de apoptosis distingue apoptosis de la necrosis por detectar específicamente la escisión del ADN y la condensación de la cromatina asociada con apoptosis. Los experimentos se realizaron en portaobjetos de 8 pocillos. Las células con núcleos teñidos se determinaron contando 100 células en 3 campos seleccionados al azar. El recuento se llevó a cabo por dos investigadores independientes. Las muestras fueron examinadas con un microscopio vertical (Olympus BX51). Proliferación celular La citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de MTT (Sigma, In Vitro Toxicología Assay). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración de 5 & # x000D7; 10 3 células / pocillo. Para el ensayo de la viabilidad de las células se expusieron a una terapia combinada con las drogas. Tras una incubación de 5 y 24 horas a 37 & # x000B0; C, se retiró el medio y 100 & # x003BC; L 0,04 mol / L de HCl en 2-propanol (Sigma) se añadió. La absorbancia a 570 nm se midió espectrofotométricamente (lector de microplacas Multiscan MS) y los resultados se expresaron como porcentaje del control sin tratar (& # x00025; de control). La inmunocitoquímica La inmunocitoquímica se realizó mediante el método ABC. Brevemente, los cultivos se fijaron y se deshidrataron utilizando 4 & # x00025; paraformaldehído y un gradiente de etanol, respectivamente. Las muestras fueron luego se permeabilizaron y se bloquearon por incubación con 0,1 & # x00025; Triton X-100 en PBS. Óxido nítrico sintasa inducible se visualizó con anticuerpo monoclonal de ratón (1: 100, NOS2 y Ki-67, Santa Cruz). Para la microscopía de campo brillante convencional (etiquetado con peroxidasa ABC), las muestras se incubaron con una diaminobencidina-H 2 O 2 mezcla de visualizar la etiqueta peroxidasa y de contraste con hematoxilina durante 30 s. Las muestras se examinaron utilizando un microscopio vertical (Olympus BX51). el número de células teñidas se determinó contando 100 células en 3 campos seleccionados al azar. El recuento se llevó a cabo por dos investigadores independientes. El resultado se consideró positivo si se observó tinción en más de 5 y # x00025; de las células. La intensidad de la tinción inmunohistoquímica se evaluó como (& # x02212;) negativo (sin reacción), (& # x0002B;) débil, (& # x0002B; & # x0002B;) moderado y (& # x0002B; & # x0002B; & # x0002B;) fuerte. Todos los experimentos fueron repetidos tres veces. inmunofluorescencia Para visualizar la expresión de la glutatión S transferasa & # x003C0; después de marcaına y lekoptin tratamiento, H9c2 células se sembraron en 600 & # x003BC; L de medio de crecimiento en un cubreobjetos de ocho cámaras (Nunc) y se cultivaron durante dos días. Las células se incubaron a continuación durante cinco horas con ambos fármacos. Después de la incubación, las células se fijaron con 99,9 & # x00025; metanol. La localización intracelular de GST-& # x003C0; (Anticuerpo policlonal de conejo, 1: 100, Novoacstra) marcada con TRITC (isotiocianato de tetrametilrodamina, longitud de onda de excitación de 541 nm y de emisión de longitud de onda de 572 nm) se controló usando un microscopio de barrido láser confocal (Olympus FluoView FV1000). fraccionamiento subcelular Las células se recogieron en 700 & # x003BC; L de tampón de lisis (50 mmol / L de Tris-HCl, 150 mmol / L de NaCl, 1 mmol / L EDTA, 1 & # x00025; Triton X-100, pH 8,0) que contiene un cóctel de inhibidores de la proteasa (Roche) y se sonicó con un Vibra-Cell YC-130PB (Labo-Plus) a nivel de 60 durante 40 s. Los lisados celulares se centrifugaron durante 20 min a 600 & # x000D7; g en una centrífuga Sigma 3K18 usando el rotor 12 154-H para sedimentar los núcleos. El sobrenadante se centrifuga a 100 000 & # x000D7; g durante 60 minutos en una centrífuga UP-65. El sobrenadante final se denominó la fracción citosólica. Las proteínas contenidas en el sobrenadante y el sedimento se sometieron a SDS-PAGE / transferencia Western. SDS-PAGE y la inmunotransferencia lisados de células enteras se caracterizaron por SDS-PAGE, de acuerdo con los métodos de Laemmli, utilizando 10 & # x00025; minigeles (Bio-Rad). Un marcador de peso molecular de color dual (Bio-Rad) se utilizó como un estándar de tamaño. Para inmunotransferencia, después de SDS-PAGE, el gel se transfirió electroforéticamente a una membrana de Immobillon P (Millipore) con tampón de transferencia (10 mmol / L Tris, 150 mmol / L de glicina, 20 & # x00025; metanol) a 4 & # x000B0; C durante 1,5 h y a 1,2 mA / 1 cm 2 de membrana. La transferencia y la inmunotransferencia se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el manual de Millipore. En pocas palabras, la membrana con proteínas transferidas se incubó a 37 & # x000B0; C durante 1 h con un anticuerpo de conejo contra GST (Santa Cruz Biotechnology) diluido a 1: 200 en 1 & # x00025; BSA en solución salina tampón de Tris-HCl que contiene 0,05 & # x00025; Tween-20 (TBS-T, 20 mmol / L de Tris-HCl, pH 7,0, 50 mmol / L de NaCl, 0,05 & # x00025; Tween-20). La membrana se incubó a 37 & # x000B0; C durante 1 h con IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma) diluido 1: 1000 en TBS-T. La membrana se lavó cuatro veces en TBS durante 10 & # x02013; 15 s después de cada incubación con anticuerpos. Las inmunotransferencias se desarrollaron con a-1- 4-cloro & # x003B1; - naphtol solución de sustrato en presencia de H 2 O 2. análisis estadístico La normalidad de las variables continuas se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. La significación de la diferencia entre los valores medios de diferentes grupos de células en comparación con el grupo control (células no tratadas) se evaluó mediante la prueba t de Student con valores de P & # x02264; 0,05 tomada como estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Statistica 6. resultados Peroxidación lipídica mioblastos de rata se incubaron durante cinco horas con marcaına o lekoptin (como un bloqueador de canal de calcio) y simultáneamente con ambos fármacos. El alto nivel de MDA (Figura 1) muestra que marcaına aumenta la concentración de MDA en H9c2 células a 0.726 & # x000B1; 0,45 & # x003BC; mol / L. Sin embargo, también se observó un aumento en las células tratadas con lekoptin (0,565 x000B1 & #; & # 0,369 x003BC; mol / L). La incubación con ambos fármacos dio lugar a un menor nivel de MDA que en las células control (Figura 1). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Los niveles de MDA en H9c2 células tratadas con marcaına (CM = 6 & # x003BC; g / ml) y marcaına más lekoptin (CM = 6 & # x003BC; g / ml y CL = 952 & # x003BC; g / ml) en comparación con los controles. Las barras de error indican desviaciones estándar. Figura completa y la leyenda (35K) ensayo cometa alcalino (ACA) Los resultados de ACA se muestran en la Figura 2. El mayor número de células apoptóticas se observó en las células tratadas sólo con marcaına (65 & # x00025; & # x000B1; 5,7 & # x00025; de las células). Los resultados obtenidos para marcaına fueron estadísticamente significativas. Las células tratadas con lekoptin, tratadas simultáneamente con ambos fármacos mostraron el mismo nivel de apoptosis (54,2 & # x00025; & # x000B1; 1,775 & # x00025; de las células). Sorprendentemente, algunas células necróticas (5,25 & # x00025; & # x000B1; 6.625 & # x00025;) se observaron entre las células tratadas con lekoptin. El mismo nivel (13,95 & # x00025; & # x000B1; 1,6 & # x00025; de las células) de los daños intermedio se observó en las células de combinación y de control de drogas (14,4 & # x00025; & # x000B1; 4.825 & # x00025;). El porcentaje de núcleos con daño del ADN en H9c2 células tratadas con marcaına (c M = 6 & # x003BC; g / ml) y marcaına más lekoptin (c M = 6 & # x003BC; g / ml y c L = 952 & # x003BC ; g / ml) en comparación con los controles. Las barras de error indican desviaciones estándar. b p <0,05 vs grupo tratado marcaına. Figura completa y la leyenda (53K) ensayo de MTT La función mitocondrial oxidoreductive se muestra en la Figura 3. El 24-h de incubación con marcaına resultó en el mayor daño a la función mitocondrial (16,29 & # x00025; & # x000B1; 0,075 & # x00025; en comparación con el nivel de células de control). Los niveles de viabilidad después de 5 y 24 h con lekoptin fueron comparables y superó 100 & # x00025; de las células de control. En las células tratadas con ambos fármacos, se observó una disminución estadísticamente significativa en la viabilidad después de 24 h, a 17,57 & # x00025; & # X000B1; 0,086 & # x00025; de la de las células de control. La terapia post incubación de 5 h fue la primera etapa en la que los cambios en las células se observaron. Se estableció el período de 24 horas después de la terapia para el ensayo de citotoxicidad. Después de ese período, no se detectaron cambios significativos. El efecto de lekoptin y marcaına sobre la proliferación de células H9c2 como evaluó mediante el ensayo de MTT. Las barras de error indican las desviaciones estándar (SD & # máximo x000B1; 1,02; & # x000B1 mínimo; 0,15). b p <0,05 vs grupo tratado marcaına. Figura completa y la leyenda (37K) ensayo de TUNEL Figura 4 muestra el ensayo de TUNEL H9c2. Las células incubadas con marcaına y con ambos fármacos mostraron la más fuerte positividad TUNEL (como se ensayó por los núcleos de células manchadas) (Figura 4A, 4B). se observaron células apoptóticas individuales (no presente) en las células tratadas con lekoptin o en las células de control (Figura 4C, 4D. Tabla 1). tinción TUNEL en las células tratadas con H9c2 marcaına (A), marcaına más lekoptin (B), lekoptin (C), y las células de control (D): Apoptosis. (& # X000D7; 400). Figura completa y la leyenda (73K) la expresión de iNOS La máxima expresión de la óxido nítrico sintasa inducible también se observó para las células tratadas con marcaına y ambos marcaına y lekoptin (Figura 5A, 5B). En las células incubadas sólo con la lekoptin, no se observó expresión significativa iNOS (figuras no incluidas); los resultados fueron comparables a la de las células control (Tabla 2). la expresión de iNOS en las células tratadas con H9c2 marcaına (A) y marcaına más lekoptin (B). (& # X000D7; 400). Figura completa y la leyenda (63K) la expresión de Ki67 La expresión de un marcador para la proliferación celular (Ki-67) se presenta en la Figura 6A & # x02013; 6D). En las células tratadas con marcaına la reacción fue de aproximadamente 5 & # x00025 ;. comparable con la de las células control (figuras 6A, 6D). La tinción nuclear fuerte se observó en las células tratadas con lekoptin (Figura 6C) y ambos fármacos (Figura 6B. Tabla 3). Ki-67 inmunocitoquímica en células H9c2. (A) las células de control, (B) marcaına más lekoptin, lekoptin (C) y (D) marcaına. Figura completa y la leyenda (99K) GST-& # x003C0; expresión y immunoblotting La expresión de la transferasa de glutatión S-& # x003C0; demostrado una localización nuclear específica en las células tratadas con ambos fármacos (Figura 7B). En las células tratadas sólo con marcaına, GST-& # x003C0; se observó expresión en el citoplasma y la envoltura nuclear (Figura 7A). Las células de control y células tratadas con lekoptin demostraron expresión de la enzima muy débil (datos no mostrados). Para complementar los resultados de inmunofluorescencia, la inmunotransferencia de las fracciones citosólicas y nucleares se realizó y presentó en la Figura 8. Esto nos permitió demostrar una banda de proteína inmunorreactiva característica a 26 y 50 kDa, particularmente en la fracción nuclear de H9c2. En la fracción citosólica observamos bandas divididas de NF & # x003BA; B proteína p50-GST (50 kDa) para las muestras tratadas con marcaına y de control de las células. Las mismas sondas también indicaron ninguna expresión significativa de proteínas de fusión GST (26 kDa). La tinción fue detectable en la fracción nuclear de todas las muestras (que era la banda más débil de la sonda de control). La banda más fuerte apareció para las células tratadas con lekoptin, seguido de marcaına y ambos fármacos. Esto es en parte una confirmación de inmunomarcación fluorescente en microscopía confocal, pero este buen resultado es inesperado inmunotransferencia para el tratamiento lekoptin. inmunomarcación fluorescente de GST-& # x003C0; en H9c2 células con marcaına (A) y marcaına más lekoptin (B). (& # X000D7; 1000). Figura completa y la leyenda (110K) Inmunotransferencia (A & # x02013; B) de 60 & # x003BC; g de proteínas. La inmunotransferencia se realizó con anticuerpo de conejo producido contra una secuencia de GST de Schistosoma japonicum origen. Las células fueron tratadas como se indica: M & # x02013; marcaına, L & # x02013; lekoptin, M & # x0002B; L & # x02013; marcaına y lekoptin, C & # x02013; las células de control no tratadas; ST & # x02013; estándar. Figura completa y la leyenda (45K) Discusión El presente estudio mostró que el efecto citotóxico de marcaına en mioblastos de rata in vitro. Cinco horas de incubación con marcaına llevaron a niveles más altos de la peroxidación de lípidos, niveles más altos de expresión de iNOS y GST-& # x003C0 ;. y la acción perjudicial sobre la función mitocondrial. Además, marcaına causó daño de la membrana y, finalmente, la muerte celular. Las mitocondrias han sido recientemente demostrado estar involucrados en la apoptosis y han sido implicados en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Singh et al sugieren que el ADN mitocondrial determina la respuesta celular a la terapéutica del cáncer y algunos medicamentos pueden inducir mutaciones en el genoma mitocondrial 28. Hay una pregunta de si las mutaciones similares podrían ocurrir en las células cardiacas normales. Nuestros resultados muestran que marcaına induce principalmente la fase tardía de la apoptosis (ensayo cometa) y provoca cambios irreparables en las células. Al contrario de los efectos terapéuticos de marcaına, aplicación lekoptin indicado un papel protector para la línea celular H9c2 y la estimulación de la proliferación celular más. Estos resultados fueron confirmados por el ensayo de MTT y el etiquetado Ki67. En las células incubadas sólo con lekoptin observamos núcleos apoptóticos sola (ensayo TUNEL). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que este mecanismo puede explicar el efecto protector de la lekoptin contra el estrés oxidativo en este modelo. La acción de lekoptin tiene membrana propiedades de estabilización que pueden inducir cambios en la polarización de la membrana. Bloquea los canales de calcio, que hace que una acción más intensa de marcaına. Isomoto et al demostraron que los bloqueadores selectivos de Na & # x0002B ;. K & # x0002B ;. y Ca 2 & # x0002B; canales o & # x003B2; receptor adrenérgico no indujo apoptosis en células H9c2, pero los autores indicaron que algunos medicamentos antiarrítmicos tuvieron un efecto pro-apoptótica en células cardiacas 15 (por ejemplo, amiodarona.). Al igual que en nuestro estudio, otros han demostrado que la expresión de este sintasa se incrementó marcadamente en los cardiomiocitos y células endoteliales en los corazones de ratas espontáneamente hipertensas, lo que indica un significado fisiopatológico de la alteración de la expresión de iNOS 12. Algunos estudios han demostrado que la bupivacaína induce la apoptosis en la línea celular RT4-D6P2T, que puede estar asociada con la producción de ROS 29. 30. El nivel de ROS fue elevado en las células de Schwann en el período temprano de la apoptosis inducida por la bupivacaína. En contraste con nuestro estudio, estos autores no observaron un aumento significativo de nivel de NO 31. Feinstein et al mostraron que la bupivacaína causa la muerte celular en miocitos cardiacos y dibucaína induce la apoptosis en células HL-60 32. En otro estudio, verapamil y nimodipina, fármacos que reducen automatismo cardíaco, eran eficaces en la disminución de la toxicidad cardiaca inducida por bupivacaína racémica 24. El glutatión S-transferasa (GST) isoenzimas son importantes en la detoxificación de productos de peroxidación de lípidos; se unen glutatión (GSH) a una variedad de electrófilos, incluyendo carcinógenos y fármacos citotóxicos 14. Las isoenzimas de la clase pi son altamente sensibles a los ROS. En el presente estudio hemos demostrado el aumento de la expresión de la enzima de desintoxicación GST & # x003C0 ;. después del tratamiento con marcaına. Vander Heide et al han demostrado que el aumento de la expresión regulada de GST en mioblastos cardiacos protegidas contra la muerte celular inducida por la antraciclina 33. Nuestros datos indican una correlación entre el estrés oxidativo y la muerte celular después del tratamiento marcaına, que se redujo por GST-& # x003C0; sobreexpresión. Esto sugiere que el estrés oxidativo es importante tanto en la muerte celular apoptótica y necrótica. L'Ecuer y col indicó que la sobreexpresión de GST elimina el estrés oxidativo generado por la doxorrubicina en la línea celular H9c2. Los autores sugieren que otros factores, además de estrés oxidativo jugaron un papel en la muerte celular inducida por DOX 14. En contraste con nuestro estudio, algunos autores indican única expresión de GST-cytoplasmaic & # x003C0; en las células normales 34. Nuestros resultados mostraron una expresión nuclear inesperado de esta enzima en las células incubadas con marcaına y lekoptin. Sin embargo, otros autores han demostrado que la expresión nuclear de esta enzima es característica de las células neoplásicas 35. lo que sugiere que hay cambios neoplásicos en las células inducidas por fármacos aplicados. Sin embargo, algunos autores sugieren que la sobreexpresión de GST puede ser una parte importante de una estrategia de protección contra la muerte celular inducida por fármacos 14. En conclusión, nuestro estudio confirma la evidencia de una interacción entre estos dos fármacos, que podrían ser de importancia en la práctica clínica. El presente estudio in vitro demostró una interacción entre marcaına y lekoptin afectar a la respuesta de los mioblastos de rata con el estrés oxidativo. Hemos demostrado que marcaına puede inducir apoptosis en cardiomiocitos, que puede estar mediada por el aumento de los niveles intracelulares de estrés oxidativo que implican la activación de óxido nítrico sintasa inducible. se verificó la acción protectora de lekoptin contra marcaına y el estrés oxidativo y la contribución del mecanismo de desintoxicación GST. Hay una necesidad de más estudios para explicar el mecanismo de esta interacción. contribución autor Julita KULBACKA y Jolanta SACZKO investigación diseñados; Agnieszka CHWILKOWSKA, Malgorzata DUMANSKA, Malgorzata DRAG-ZALESINSKA, Teresa Wysocka, Kamilla STACH, Iwona Bednarz y Mateusz Ługowski realizó la investigación; Julia BAR y Anna Marcinkowska contribuido nuevos reactivos o herramientas analíticas; Julita KULBACKA, Jolanta SACZKO y Julia BAR analizaron los datos; Julita KULBACKA y Andrzej GAMIAN escribió el documento. referencias Berthel H, Ebel D, J Mullenheim, Obal D, Preckel B, Schlack W. 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